Các xét nghiệm đông máu: Xét nghiệm chất ức chế (Inhibitor Assays)

Xét nghiệm Bethesda có thể làm tăng tỷ lệ dương giả ở nồng độ chất ức chế thấp [<1 Bu] trong khi đó hiệu chỉnh Nijmegen sẽ đưa về mức không. Những thay đổi trong pH và nồng độ protein có thể ảnh hưởng đến tính ổn định của yếu tố VIII và sự bất hoạt của nó tăng lên khi pH tăng và nồng độ protein thấp. Bằng việc đệm bằng huyết tương bình thường và sử dụng huyết tương thiếu FVIII, những biến đổi này sẽ được loại bỏ hoặc tối thiểu. Hiệu chỉnh Nijmegen trong xét nghiệm chất ức chế FVIII liên quan đến việc sử dụng huyết tương bình thường đệm với 0.1M Imidazole tại pH bằng 7.4 và sử dụng huyết tương thiếu FVIII trong hỗn hợp chứng

Xét nghiệm Bethesda được thiết kế để đo những chất ức chế FVIII ở bệnh nhân haemophilia A. Tuy nhiên, nó được dùng để kiểm tra và báo cáo những chất ức chế liên kết với các yếu tố đông máu khác như FXI, FIX… Nguyên lý tương tự, mặc dù trong một số trường hợp, protein phản ứng ngay lập tức với chất ức chế  nên không đòi hỏi thời gian ủ (như FIX)

Ở những bệnh nhân mà động học chất ức chế phức tạp như phổ biến hay gặp ở bệnh nhân có chất ức chế mắc phải (như chất ức chế FVIII mắc phải) – nồng độ chất ức chế tính được có thể tăng khi độ pha loãng tăng.

Sàng lọc chất ức chế VWF bằng phương pháp xác định chất ức chế cổ điển (trộn huyết tương bình thường và huyết tương test, sau đó đo mức VWF) là rất khó. Xét nghiệm chất ức chế theo kiểu Bethesda chuẩn thường xuyên thất bại trong việc xác định chất ức VWF. Xét nghiệm ELISA đã được giới thiệu để tìm kiếm chất ức chế VWF, nhưng lại một lần nữa không phải luôn luôn xác định được kháng thể. Tiền sử có thể rất quan trọng trong những trường hợp này, một tiền sử không ghi nhận những rối loạn chảy máu thường xuyên mãi cho tới gần đây. Thời gian bán hủy của VWF truyền vào cũng giảm đáng kể và xác nhận điều này rất có giá trị. Đo tỉ số VWF:pp/VWF:Ag có thể rất hữu ích.

GIỚI THIỆU

Chất ức chế là những kháng thể mà trong hoạt động đông máu, đích nó chống lại thường là:

Những yếu tố đông máu đặc hiệu (như FVIII)

Phospholipid như LA (thật ra hầu hết LA chống lại trực tiếp phức hợp proteinphospholipid)

Một chất ức chế thường được nghi ngờ từ tiền sử hoặc xét nghiệm đông máu kéo dài không hiệu chỉnh lại được với mix test (50:50). Những chất ức chế phổ biến nhất là chống lại phospholipid – LA.

Những chất ức chế hoặc kháng đông lưu hành chống lại các yếu tố đông máu có thể hoặc phụ thuộc thời gian (như chất ức chế FVIII) hoặc phản ứng ngay lập tức (như chất ức chế FIX).

NGUYÊN LÝ VÀ PHƯƠNG PHÁP

XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC DỰA VÀO APTT

Sàng lọc chất ức chế dựa vào APTT và liên quan đến việc đo APTT của mẫu huyết tương trước và sau khi nó được ủ 37 độ C. 3 ống được chuẩn bị như bảng bên dưới. Các ống này được ủ ở 37 độ C trong 120 phút và sau đó đặt trong nước đá để làm ngừng phản ứng. Ống thứ 4 được chuẩn bị từ một thể tích bằng nhau của ống 1 và ống 2, APTT được thực hiện ở cả 4 ống.

Giải thích kết quả của các APTT  thu được từ 4 ống như sau:

Nên nhớ rằng, một xét nghiệm sàng lọc thì cần nhạy chứ không cần đặc hiệu. Vì vậy nó có thể xác định chất ức chế của tất cả yếu tố nhưng nó rất không đặc hiệu, tuy nhiên khi test sàng lọc dương tính, bạn có thể điều tra chi tiết hơn bằng xét nghiệm Bethesda.

XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG: XÉT NGHIỆM BETHESDA

Xét nghiệm Bethesda được dùng một cách rộng rãi để định lượng nồng độ của chất ức chế FVIII.

1 đơn vị Bethesda (Bu) được định nghĩa là số lượng một chất ức chế cần để trung hòa 50%

1 đơn vị FVIII:C trong huyết tương bình thường sau 120 phút ủ ở 37 độ C. Chất ức chế FVIII là phụ thuộc thời gian trong khi những loại khác là phản ứng tức thì (như FIX) và vì vậy không đòi hỏi một bước ủ. Tuy nhiên, những nguyên lý cơ bản là giống nhau.

Vì chất ức chế FVIII là phụ thuộc thời gian, nếu FVIII ngoại sinh được thêm vào huyết tương và hỗn hợp được ủ, FVIII sẽ bị trung hòa tăng dần. Nếu số lượng FVIII được thêm vào và thời gian ủ được chuẩn hóa thì độ mạnh hoặc nồng độ của chất ức chế có thể đo được theo đơn vị là bao nhiêu FVIII thêm vào bị phá hủy. Xét nghiệm này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng cả FVIII nguồn gốc từ người lẫn từ lợn (FVIII của lợn hiện không có sẵn, sản phẩm tái tổ hợp của nó đang được phát triển).

Hiệu chỉnh Nijmegen của xét nghiệm chất ức chế FVIII liên quan đến việc đệm huyết tương bình thường với 0.1M imidazole tại pH 7.4 và sử dụng huyết tương đã loại bỏ FVIII bằng phương pháp miễn dịch, để tạo thành hỗn hợp chứng. Ở hiệu giá chất ức chế thấp (<1 Bu), xét nghiệm Bethesda cổ điển có thể cho ra dương tính giả trong khi đó hiệu chỉnh Nijmegen sẽ đưa ra mức ức chế là 0.

Xét nghiệm Bethesda:

Đơn vị Bethesda (Bu) được định nghĩa là lượng chất ức chế trong mẫu huyết tương có thể trung hòa 50% 1 đơn vị FVIII:C trong huyết tương bình thường sau khi ủ 2h ở 37 độ C.

Pha loãng gấp đôi huyết tương bệnh nhân (thường từ ½-1/1024) trong chất đệm Imidazole được ủ với một lượng thể tích bằng nhau với “huyết tương bình thường pool” tại 37 độ C.