Sperling Nội tiết học Nhi khoa, Ấn bản thứ 5 – Biên dịch: Ths.Bs. Lê Đình Sáng
Sperling Pediatric Endocrinology, Fifth Edition
Tác giả: Sperling, Mark A., MD – Nhà xuất bản: Elsevier Inc.

PHẦN I: CÁC NGUYÊN LÝ VÀ PHƯƠNG PHÁP CỦA NỘI TIẾT HỌC NHI KHOA

CHƯƠNG 2: NỘI TIẾT HỌC PHÂN TỬ, DI TRUYỀN HỌC NỘI TIẾT, VÀ Y HỌC CHÍNH XÁC

Molecular Endocrinology, Endocrine Genetics, and Precision Medicine
Ram K. Menon; Massimo Trucco; Joseph A. Majzoub; Constantine A. Stratakis
Sperling Pediatric Endocrinology, 2, 9-29

GIỚI THIỆU

Nghiên cứu về hệ nội tiết đã trải qua một sự phát triển vượt bậc kể từ những năm 1990, từ các nghiên cứu sinh lý học truyền thống chiếm ưu thế trong nhiều năm đến những khám phá của nội tiết học phân tử (molecular endocrinology) và di truyền học nội tiết (endocrine genetics). Hiện tại, tác động lớn của y học phân tử đối với thực hành nội tiết nhi khoa liên quan đến chẩn đoán và tư vấn di truyền cho nhiều rối loạn nội tiết di truyền khác nhau. Ngược lại, việc áp dụng trực tiếp kiến thức mới này vào điều trị vẫn còn ở giai đoạn sơ khai. Ung thư học nội tiết đã được hưởng lợi rất nhiều từ việc áp dụng các loại thuốc mới được thiết kế để nhắm vào các đột biến cụ thể, ví dụ như trong ung thư tuyến giáp. Một tiến bộ điều trị đáng chú ý gần đây sau khi xác định được cơ sở phân tử của một rối loạn nội tiết là sự phát triển của kháng thể đơn dòng burosumab nhắm vào protein yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi-23 để điều trị bệnh còi xương hạ phosphat máu liên kết nhiễm sắc thể X (X-linked hypophosphatemic rickets). Chương này giới thiệu các nguyên tắc cơ bản của sinh học phân tử, các kỹ thuật phòng thí nghiệm phổ biến, và một số ví dụ về những tiến bộ gần đây trong các rối loạn nội tiết nhi khoa lâm sàng với trọng tâm là di truyền học nội tiết. Hầu hết các xét nghiệm chẩn đoán, dược lý di truyền, và liệu pháp phân tử mới đều được thảo luận trong các chương cụ thể về bệnh của cuốn sách này, và chỉ những ví dụ làm nổi bật nguyên tắc/chiến lược đang được thảo luận mới được đề cập trong chương này.

CÁC CÔNG CỤ PHÂN TỬ CƠ BẢN

Phân lập và Cắt DNA và Thấm Southern (Southern Blotting)

Nhiễm sắc thể của con người bao gồm một phân tử xoắn kép dài của acid deoxyribonucleic (DNA) (deoxyribonucleic acid) liên kết với các protein nhân khác nhau. Vì DNA là điểm khởi đầu của quá trình tổng hợp tất cả các phân tử protein trong cơ thể, các kỹ thuật phân tử sử dụng DNA đã chứng tỏ vai trò quan trọng trong việc phát triển các công cụ chẩn đoán để phân tích các bệnh nội tiết. DNA có thể được phân lập từ bất kỳ mô nào của con người, bao gồm cả các tế bào bạch cầu lưu thông. Khoảng 200 µg DNA có thể được thu nhận từ 10 đến 20 mL máu toàn phần, với hiệu quả chiết xuất DNA phụ thuộc vào kỹ thuật được sử dụng và phương pháp chống đông. DNA đã chiết xuất có thể được lưu trữ gần như vô thời hạn ở nhiệt độ thích hợp. Hơn nữa, các tế bào lympho có thể được biến đổi bằng virus Epstein-Barr (hoặc các phương tiện khác) để tăng sinh vô hạn trong nuôi cấy tế bào thành các dòng tế bào “bất tử”, do đó cung cấp một nguồn DNA tái tạo. Để thực hiện các nghiên cứu di truyền phân tử, các dòng tế bào lympho biến đổi thường là mô được lựa chọn, bởi vì một nguồn DNA tái tạo giúp loại bỏ nhu cầu lấy thêm máu từ gia đình. Các dòng nuôi cấy có nguồn gốc từ nguyên bào sợi cũng có thể đóng vai trò là nguồn DNA hoặc acid ribonucleic (RNA) (ribonucleic acid) vĩnh viễn (một khi đã được biến đổi), nhưng chúng phải được lấy từ các mẫu phẫu thuật hoặc sinh thiết. Cần lưu ý rằng, vì sự biểu hiện của nhiều gen là đặc hiệu cho từng mô, các dòng tế bào lympho hoặc nguyên bào sợi bất tử không thể được sử dụng để phân tích sự phong phú hoặc thành phần của RNA thông tin (mRNA) (messenger RNA) cho một gen cụ thể. Do đó, các nghiên cứu liên quan đến mRNA đòi hỏi phải phân tích (các) mô biểu hiện gen đó, như được nêu trong phần “Phân tích RNA”. Gần đây, vấn đề về lượng DNA hạn chế có thể thu được từ một số nguồn nhất định đã được khắc phục bằng việc sử dụng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) (polymerase chain reaction), một phương pháp linh hoạt để nhân lên một cách trung thực các đoạn DNA ban đầu.

Hình 2.1 Thấm Southern. Các đoạn DNA sợi đôi được phân tách theo kích thước bằng điện di trên gel agarose. Để làm cho DNA trở thành sợi đơn (biến tính), gel agarose được ngâm trong dung dịch acid. Sau khi trung hòa acid, gel được đặt lên giấy lọc, các đầu của giấy lọc nằm trong một bể chứa dung dịch đệm muối đậm đặc. Một tấm màng nitrocellulose được đặt lên trên gel và giấy thấm được xếp chồng lên trên màng nitrocellulose. Dung dịch muối được hút lên qua gel nhờ tác động mao dẫn của bấc giấy lọc và giấy thấm. Khi dung dịch muối di chuyển qua gel, nó mang theo các đoạn DNA. Vì nitrocellulose liên kết với DNA sợi đơn, các đoạn DNA được lắng đọng lên nitrocellulose theo đúng khuôn mẫu mà chúng đã được đặt trong gel agarose. Các đoạn DNA liên kết với nitrocellulose được cố định vào màng bằng nhiệt hoặc tia cực tím. Màng nitrocellulose với DNA đã liên kết sau đó có thể được sử dụng cho các quy trình, chẳng hạn như lai với một mẫu dò DNA được đánh dấu. Các kỹ thuật chuyển DNA sang các chất nền liên kết khác, chẳng hạn như nylon, cũng tương tự.

DNA tồn tại dưới dạng các phân tử cực lớn; nhiễm sắc thể thường nhỏ nhất (nhiễm sắc thể 22) có khoảng 50 triệu cặp base và toàn bộ bộ gen đơn bội của con người được ước tính bao gồm 3 đến 4 tỷ cặp base. Kích thước cực lớn này ngăn cản việc phân tích DNA ở dạng tự nhiên trong các kỹ thuật sinh học phân tử thông thường. Các kỹ thuật nhận dạng và phân tích DNA đã trở nên khả thi và dễ tiếp cận với việc phát hiện ra các enzyme được gọi là endonuclease giới hạn (restriction endonucleases). Các enzyme này, ban đầu được phân lập từ vi khuẩn, cắt DNA thành các kích thước nhỏ hơn dựa trên các vị trí nhận biết cụ thể dài từ hai đến tám cặp base. Thuật ngữ giới hạn đề cập đến chức năng của các enzyme này trong vi khuẩn. Một endonuclease giới hạn phá hủy DNA ngoại lai (chẳng hạn như DNA của thể thực khuẩn) bằng cách cắt DNA tại các vị trí cụ thể, do đó “hạn chế” sự xâm nhập của DNA ngoại lai vào vi khuẩn. Hàng trăm enzyme giới hạn với các vị trí nhận biết khác nhau hiện có sẵn trên thị trường. Vì vị trí nhận biết của một enzyme nhất định là cố định, số lượng và kích thước của các đoạn được tạo ra cho một phân tử DNA cụ thể vẫn nhất quán với số lượng vị trí nhận biết và cung cấp các khuôn mẫu có thể dự đoán được sau khi phân tách bằng điện di.

Việc phân tích vài trăm cặp base DNA trong vùng quan tâm là rất khó khăn khi DNA từ tất cả các nhiễm sắc thể của con người được cắt và phân tách trên cùng một gel. Những hạn chế này được khắc phục bằng kỹ thuật thấm Southern (Southern blotting) (được đặt theo tên của người phát minh ra nó, Edward Southern). Thấm Southern bao gồm việc cắt DNA và phân tách bằng điện di trên agarose. Sau khi điện di, DNA được chuyển sang một giá đỡ rắn (chẳng hạn như màng nitrocellulose hoặc nylon), cho phép sao chép khuôn mẫu của các đoạn DNA đã phân tách lên màng (Hình 2.1). Sau đó, DNA được biến tính (tức là hai sợi được tách rời vật lý), cố định vào màng, và màng khô được trộn với dung dịch chứa mẫu dò DNA. Mẫu dò DNA (DNA probe) là một đoạn DNA chứa một chuỗi nucleotide đặc hiệu cho gen hoặc vùng nhiễm sắc thể quan tâm. Để phát hiện, mẫu dò DNA được đánh dấu bằng một thẻ nhận dạng, chẳng hạn như phốt pho phóng xạ (ví dụ 32P) hoặc một gốc phát quang hóa học; loại sau hiện nay đã gần như thay thế hoàn toàn phóng xạ. Quá trình trộn mẫu dò DNA với DNA biến tính được cố định trên màng được gọi là lai hóa (hybridization), nguyên tắc là chỉ có bốn base acid nucleic trong DNA—adenine (A), thymidine (T), guanine (G), và cytosine (C)—luôn bổ sung cho nhau trên hai sợi DNA, A bắt cặp với T, và G bắt cặp với C. Sau khi lai hóa, màng được rửa để loại bỏ mẫu dò không liên kết và được phơi sáng với phim X-quang trong một quá trình gọi là chụp tự ghi phóng xạ (radioautography, còn gọi là autoradiography) để phát hiện phốt pho phóng xạ hoặc trong một quá trình được sử dụng để phát hiện thẻ phát quang hóa học. Chỉ những đoạn bổ sung và đã liên kết với mẫu dò chứa DNA quan tâm mới hiện rõ trên phim X-quang, cho phép phân tích kích thước và khuôn mẫu của các đoạn này. Theo quy trình thông thường, kỹ thuật phân tích Southern có thể phát hiện một gen đơn bản trong ít nhất 5 µg DNA, tương đương với hàm lượng DNA của khoảng 10 tế bào.

Đa hình Chiều dài Đoạn cắt Giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP)

Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (RFLP) (Restriction fragment length polymorphism) là một kỹ thuật hiện nay hiếm khi được sử dụng nhưng lại xuất hiện rộng rãi trong y văn di truyền học nội tiết, vì một số khám phá di truyền nội tiết trong 2 đến 3 thập kỷ qua đã dựa trên kỹ thuật này. Số lượng và kích thước của các đoạn DNA do việc cắt một vùng DNA cụ thể tạo thành một khuôn mẫu có thể nhận biết được. Những biến thể nhỏ trong trình tự giữa các cá thể không có quan hệ họ hàng có thể làm cho một vị trí nhận biết của enzyme giới hạn có mặt hoặc vắng mặt; điều này dẫn đến sự thay đổi về số lượng và khuôn mẫu kích thước của các đoạn DNA được tạo ra bởi việc cắt bằng enzyme đó. Do đó, vùng này được cho là đa hình đối với enzyme cụ thể được thử nghiệm, tức là một RFLP (Hình 2.2). Giá trị của RFLP là nó có thể được sử dụng như một thẻ phân tử để theo dõi sự di truyền của các alen từ mẹ và cha. Hơn nữa, vùng đa hình được phân tích không cần phải mã hóa cho biến thể di truyền là nguyên nhân của bệnh đang được nghiên cứu, mà chỉ cần nằm gần gen quan tâm. Khi một khuôn mẫu RFLP cụ thể có thể được chứng minh là có liên quan đến một bệnh, việc so sánh khuôn mẫu RFLP của con cái với khuôn mẫu RFLP của cha mẹ bị ảnh hưởng hoặc mang gen có thể xác định khả năng một người con thừa hưởng bệnh. Hạn chế chính của kỹ thuật RFLP là khả năng ứng dụng của nó để phân tích bất kỳ gen cụ thể nào phụ thuộc vào kiến thức trước đó về sự hiện diện của các vị trí giới hạn đa hình thuận tiện (“có thông tin”) nằm cạnh gen quan tâm trong khoảng tối đa vài kilobase. Vì những tiêu chí này có thể không được đáp ứng trong bất kỳ trường hợp nào, khả năng ứng dụng của RFLP không thể được đảm bảo cho việc phân tích một gen nhất định.